Universitätsinstitut für Medizinisch-Chemische Labordiagnostik - Zentrallabor LKH
Landeskrankenhaus
Müllner Hauptstraße 48
A-5020 Salzburg
Fax: +43 (0) 5 7255 – 23198
Email: zentrallabor-office@salk.at
a.o. Univ. Prof. Dr. Janne Cadamuro
Fax: +43 (0) 5 7255 – 23198
Email: j.cadamuro@salk.at
Hevylite Teste: Sensitives Monitoring von Erkrankungen mit monoklonalen Immunglobulinen (MM, Plasmocytom, B-NHL)
(20.02.2012)
Die Diagnostik der monoklonalen Gammopathien stützt sich auf den Nachweis eines M-Gradienten in der Elektrophorese, Quantifizierung der Immunglobuline und der Berechnung der Ratio aus dn gebundenen Leichtketten, Quantifizierung der Freien Leichtketten und Bestimmung deren Ratio oder Differenz.
Für die Bestätigung des klonalen Charakters einer Immunglobulin- bzw. Leichtkettenproliferation gilt die Immunfixation (IFE) als Goldstandard. Da es sich aber dabei um eine in der Sensitivität limitierte qualitative Analyse handelt, können geringe monoklonale Anteile an Immunglobulinen nicht mehr sicher erkannt werden. Dies ist für die Beurteilung einer Remission oder das frühe Erkennen eines Rezidivs von entscheidendem Nachteil.
Mit der Bestimmung der HEVYLITE CHAIN RATIO (HLC), d.h. Messung von lgG/kappa und lgG/lambda und Berechnung der Ration bzw. lgA/kappa und lgA/lambda und Berechnung der Ration bzw. lgM/kappa und Berechung der Ration bzw. lgM/kappa und lgM/lambda und Berechung der Ration kann einerseits ein Rezidiv früher erkannt, andererseits die Remission sicherer eurteilt werden als imit der IFE alleine.
Die Analysen können auf dem Routineschein (Rubrik: Elektrophorese) gemeinsam mit Elektrophorese, Imunglobulinen (sFL) und Immunfixation anfeordert werden. Der Test wird 1x pro Woche durchgeführt.
Literatur:
Bradwell et al. Clinical Chemistry 2009; 55(9): 1646-1655
Donato et al. Clinical Chemistry 2011; 57(12): 1645-1649
Quelle: www.wikilite.com, Chapter 32
Anteil unreifer Thrombozyten
(11.10.2010)
Dieser Parameter dient bei Thrombopenien zur Differenzierung zwischen vermindertem Verbrauch und vermehrtem peripheren Abbau.
Vereinfacht gesagt:
Knochenmarksversagen: unreife Thrombozyten nicht erhöht,
Thrombozytenverbrauch: unreife Thrombozyten erhöht.
Unreife Thrombozyten (immature platelets) sind ein bis zwei Tage alte Thrombozyten, die von den Megakaryozyten durch Abschnürung gebildet werden. Die unreifen Thrombozyten sind größer als reife und beinhalten viel RNA. Die RNA wird für die intensive Proteinsynthese benötigt, durch die aus den unreifen Thrombozyten schließlich reife, voll funktionsfähige Thrombozyten werden.
Die Angabe erfolgt in Prozent der Gesamt-Thrombozytenkonzentration.
Klinische Einsatzmöglichkeiten der Bestimmung unreifer Thrombozyten können sein:
Thrombopenien im Rahmen von
Referenzwerte sind¹: 1.1 - 6.1 %
Benötigtes Material: EDTA-Vollblut
Anforderung am: A-Schein
Referenzen:
Bei weiteren Fragen kontaktieren Sie bitte: Dr. Janne Cadamuro
Hämoglobingehalt des Einzel-Reticulocyten
30.3.2010
Mit der Bestimmung des Hämoglobins im Reticulocyten (RetHe/Sysmex) steht neuerdings ein Parameter zur Verfügung, der es mit hoher Zuverlässigkeit erlaubt, einen funktionellen Eisenmangel zu diagnostizieren und der die Standardparameter Eisen, Transferrin, Transferrin-Sättigung, sTfR und Ferritin sinnvoll ergänzt. Da Reticulocyten im peripheren Blut über 2-3 Tage zu Erythrocyten ausreifen, lässt sich aus dem erniedrigten RetHe (< 28pg) ein funktioneller Eisenmangel in der Erythropoese (länger als 3-4 Tage bestehend) sehr zuverlässig erkennen. Dies gilt besonders für Situationen wie chronische Entzündungen, Tumore und Erythropoietin-Therapie bei chronischer Dialyse.
Unter diesen Voraussetzungen ist die Indikation für eine Eisensubstitution oft schwierig zu stellen. Eine wirksame i.v. Eisentherapie zeigt sich schon nach 3-4 Tagen durch den Anstieg des RetHe in den Reticulocyten des peripheren Blutes.
Das RetHe wird am XE 2100 (Fa. Sysmex) messtechnisch aus der Fraktion der Reticulocyten erfasst und gemeinsam mit den Reticulocyten ausgegeben. Die isolierte Bestimmung des RetHe bzw. der Reticulocyten ist problematisch, da es unter bestimmten Umständen (Hämoglobinopathien, Megaloblastären Anämien und anderen hämatologischen Systemerkrankungen) zu einer Fehleinschätzung kommen kann. Die Bestimmung sollte deshalb grundsätzlich nur zusammen mit dem roten Blutbild erfolgen.
Material: EDTA-Blut
Referenzbereich: > 28 pg
Lit.: Mast AE. et al. Am. J. Hematol. 2008, 83 :307-310 ; Reticulocyte hemoglobin content
Für den Inhalt verantwortlich: OA Dr. Erich Arrer
Fetal Cell Count
30.3.2010
In der Schwangerschaft kann es unter besonderen Umständen (manuelle/operative Eingriffe, Placentalösung, Placenta praevia, abdominales Trauma, Mehrlingsschwangerschaft) zu einem vermehrten Übertritt von fetalem Blut (> 30 ml) in den Blutkreislauf der Mutter kommen (fetomaternale Blutung). Die Allogene auf den fetalen Blutzellen führen zur Bildung entsprechender Autoantikörper bei der Mutter. Besonders bei Rh D-negativen Müttern mit einem Rh D-positiven Fetus kann dies zu einer Beeinträchtigung der bestehenden und schweren Komplikationen (hämolytische Anämie) in folgenden Schwangerschaften führen. Zur Vermeidung muss Anti-RH D Immununglobulin verabreicht werden und zwar in einer Dosierung, die auf das Volumen des in den mütterlichen Kreislauf transfundierten Blutes angepasst ist.
In der täglichen Laborroutine erfolgt der Nachweis von fetalen Erythrocyten im mütterlichen Blut mikroskopisch mit dem relativ einfach durchzuführenden, aber zuverlässigen Kleihauer-Betke Test (Angabe der fetalen Erythrocyten in Promille). Die Beurteilung des Kleihauer-Betke Tests kann aber durch mütterliche F-Zellen (Erythrocyten mit einem erhöhten Anteil an HbF) erschwert oder unmöglich werden. In diesem Fall ist das Ergebnis des Kleihauer-Betke Tests durchflußcytometrisch zu überprüfen (Fetal Cell Count). Durch Verwendung einer geeigneten Antikörperkombination (Anti-HbF und Anti-Carboanhydrase) kann im Durchflußcytometer der Anteil der fetalen Erythrocyten im mütterlichen Blut sehr spezifisch und sensitiv gemessen werden.
Material: EDTA-Blut der Mutter
Referenzbereich: < 0,2 %o
Lit.: Porra V. et al. Transfusion 2007 ; 47 :1281-1289 Identification and quantification of fetal red blood cells in maternal blood by a dual-color flow cytometric method : evaluation of the Fetal Cell Count kit
Für den Inhalt verantwortlich: OA. Dr. Erich Arrer
Verfügbarkeit von automatisierter Bestimmung der Blutkörperchensenkungs-Reaktion im Zentrallabor
(15.4.2009)
Ab sofort wird die Blutkörperchensenkungs-Reaktion (BSR) im Zentrallabor automatisiert durchgeführt. Die mit der automatisierten Methode generierten Resultate zeigen eine gute Übereinstimmung mit den Resultaten, die mit der bisher verwendeten Methode nach Westergren gewonnen wurden. Es wird nur der Einstundenwert ausgegeben, da vom Zweistundenwert keine zusätzliche, klinisch relevant Information erwatet werden kann, und auch die Referenzbereiche weder für die automatisierte noch für die Westergren Methode definiert sind.
Vorteile dieser Methodenumstellung:
Die Methode kann über Orbis am A-Schein im Block Hämatologie angefordert werden.
Die Bestimmung wird Montag bis Freitag während der Routinezeiten sowie Samstag vormittags, nicht jedoch an Sonn- und Feiertagen durchgeführt.
Weiterführende Informationen finden sie in diesen Arbeiten:
Cha CH et al; Erythrocyte sedimentation rate measurements by TEST 1 better reflect inflammation than do those by the Westergren method in patients with malignancy, autoimmune disease, or infection; Am J Clin Pathol. 2009 Feb;131(2):189-94. (Pubmed Link)
Romero A et al; Length of sedimentation reaction in blood: a comparison of the test 1 ESR system with the ICSH reference method and the sedisystem 15; Clin Chem Lab Med. 2003 Feb;41(2):232-7 (Pubmed Link)
Ozdem S et al; Comparison of TEST 1 with SRS 100 and ICSH reference method for the measurement of the length of sedimentation reaction in blood; Clin Chem Lab Med 2006;44(4):407-412. (Pubmed Link)
JAK2(V617F)-Mutation
s. im Kapitel Molekulare Onkologie
Genetische Thalassämieabklärung
(30.5.2008)
Vorab einige notwendige Formulare:
Anforderung zur Abklärung einer Hämoglobinopathie (für externe Einsender) - Download
Einverständniserklärungen für genetische Untersuchungen - Download
Seit kurzem ist es in unserem Labor möglich Alpha-, sowie Beta-Thalassämien, die Sichelzellanämie und die HbC-Krankheit genetisch abklären zu lassen.
Hier einige Informationen zu diesen Erkrankungen, sowie deren Diagnostik (Kontakt Dr. Cadamuro)
Die ß-Thalassämie ist eine ererbte Erkrankung mit einer verminderten oder fehlenden Produktion von ß-Ketten (quantitativer Defekt), welche für die normale Struktur und Funktion des Hämoglobins essentiell sind. Diese Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine mikrozytäre Anämie, einen erhöhten HbA2-Anteil (>3.5%), sowie Targetzellen und einer Poikilozytose im Blutausstrich. Der Schweregrad der Manifestation hängt von der verursachenden Mutation, sowie vom Trägerstatus (heterozygot / homozygot) ab und wird nach klinischen Gesichtpunkten eingeteilt in Thalassämia minor, intermedia und major, wobei letztere vom Kleinkindalter an lebenslang transfusionsbedürftig ist.
Bei heterozygoten Merkmalsträgern findet sich die klinische Bedeutung in der Tatsache, dass viele dieser Patienten oft jahrelang fälschlicherweise im Sinne einer Eisenmangelanämien therapiert werden. Weiters ist bei diesen Patienten die Abklärung der näheren Verwandtschaft und bei Kinderwunsch eine entsprechende genetische Beratung wichtig um die Zeugung homozygoter Merkmalsträger möglichst verhindern zu können.
Die Art der Mutation, welche eine ß-Thalassämie oder deren Trait bedingt, ist äußerst vielfältig und regional verschieden. Derzeit sind über 200 Mutationen im ß-Globin Gen bekannt. Unsere genetische Diagnostik auf ß-Thalassämien ist auf den mediterranen Raum ausgelegt und umfasst 20 der wichtigsten Polymorphismen, mit welchen über 90% der ß-Globin Defekte dieser Region gefunden werden können. Aber auch andere vor allem im mittleren Osten, Indien und Südostasien häufigeren Mutationen werden teilweise detektiert. (Fig 1)
Falls bei starkem klinischen Verdacht sowie bestehender mikrozytärer Anämie ohne Hinweis auf eine Störung im Eisenstoffwechsel, oder erhöhtem HbA2-Anteil keine Mutation in unserem Test gefunden werden kann, so gibt es im Einzelfall die Möglichkeit noch weitere Regionen im ß-Globin Gen zu untersuchen.
Weiters werden auch die wichtigsten qualitativen Defekte des ß-Globin Gens (HbS und HbC) miterfasst (s. Fig. 2).
HbS führt heterozygot (HbAS) zu keiner wesentlichen Symptomatik. Ein homozygoter Defekt (HbSS) führt jedoch zu hämolytischen Anämien unterschiedlicher Ausprägung, Ikterus und gelegentlich zum Sichelzellanämie-Syndrom: Schmerzvolle Krisen, Beinulcera, Schlaganfall, Meningitis, erniedrigte Resistenz gegenüber Salmonellen und Pneumokokken.
Das pathologische Hämoglobin HbC führt in homozygoter Form (HbCC) meist zu einer chronischen hämolytischen Anämie und zu Splenomegalie. Die HbC-Anlage (HbAC) (heterozygote Form) zeigt äußerst selten klinische Symptome.
In seltenen Fällen kommen kombiniert heterozygote Hämoglobinopathien vor wie HbSC, HbSE, HbS/ß-Thal und viele mehr, welche wiederum je nach Ausprägung unterschiedliche Klinik aufweisen.
|
Position |
Sequenz Veränderung |
ß - Thal Typ |
|
-101 |
C>T |
+ |
|
-87 |
C>G |
+ |
|
-30 |
T>A |
+ |
|
cd 5 |
-CT |
0 |
|
cd 6 |
-A |
0 |
|
cd 8 |
-AA |
0 |
|
cd 8/9 |
+G |
0 |
|
cd 15 |
TGG>TGA |
0 |
|
cd 27 |
G>T (Hb Knossos) |
+ |
|
IVS 1.1 |
G>A |
0 |
|
IVS 1.5 |
G>C |
+ |
|
IVS 1.6 |
T>C |
+ |
|
IVS 1.110 |
G>A |
+ |
|
IVS 1.116 |
T>G |
0 |
|
IVS 1.130 |
G>C |
0 |
|
cd 39 |
C>T |
0 |
|
cd 44 |
-C |
0 |
|
IVS 2.1 |
G>A |
0 |
|
IVS 2.745 |
C>G |
+ |
|
Ivs 2.848 |
C>A |
+ |
| Position | Sequenz Veränderung |
| cd 6 | G>A (HbC) |
| cd 6 | A>T (HbS) |
|
Position |
Sequence alteration |
|
-a 3.7 |
single gene deletion |
|
-a4.2 |
single gene deletion |
|
-(a)20.5 |
double gene deletion |
|
--MED |
double gene deletion |
|
--SEA |
double gene deletion |
|
--THAI |
double gene deletion |
|
--FIL |
double gene deletion |
|
a1 cd 14 |
G>A |
|
a1 cd 59 |
G>A (Hb Adana) |
|
aaa anti-3.7 |
gene triplication |
|
a2 init. cd |
ATG>ACG |
|
a2 cd 19 |
-G |
|
a2 IVSI |
5bp deletion |
|
a2 cd 59 |
G>A |
|
a2 cd 125 |
T>C (Hb Quong Sze) |
|
a2 cd 142 |
T>C (Hb Constant Spring) |
|
a2 cd 142 |
T>A (Hb Icaria) |
|
a2 cd 142 |
A>T (Hb Pakse) |
|
a2 cd 142 |
A>C (Hb Koya Dora) |
|
a2 poly A-1 |
AATAAA>AATAAG (Saudi type) |
|
a2 poly A-2 |
AATAAA>AATGAA (Turkish type) |
Die Alpha-Thalassämie ist eine nicht minder bedeutende ererbte Erkrankung mit Minder- oder fehlenden Produktion von Alpha-Ketten (quantitativer Defekt). Die Alpha-Thalassämie ist um
Einiges schwerer zu erkennen, da meist lediglich eine Mikrozytose ohne Hinweis auf einen Eisenmangel vorliegt. Die HPLC-Analyse und die elektrophoretische Hämoglobinauftrennung ergeben
hier keinerlei pathologischen Befund. Die endgültige Diagnose kann nur mittels genetischer Analyse erfolgen.
Das Krankheitsbild wird durch die Zahl der noch funktionierenden α-Gene bestimmt. Bei der schwersten Form, der Inaktivierung aller vier α-Gene (--/--), kommt es zum Hydrops foetalis. Wenn drei Gene inaktiv sind (-α/--), liegt die so genannte HbH-Krankheit vor, welche prä- und postnatal zu hämolytischer Anämie führt. Die restlichen Formen der Alpha-Thalassämie, die Deletion eines (-α/αα), oder zweier Gene in trans(-α/-α), oder in cis (--/αα) führen meist lediglich zu einer milden mikrozytären Anämie, welche zwar nicht behandlungsbedürftig ist, jedoch aus Sicht einer genetischen Beratung dringend richtig zu diagnostizieren ist.
Unsere genetische Diagnostik auf Alpha-Thalassämien erfasst 21 der wichtigsten Mutationen des Alpha-Globin Gens und deckt damit >90% der Alpha-Globin Defekte des mediterranen Raum, des mittleren Ostens und des südostasiatischen Bereichs ab. (Fig 3)
Bitte beachten Sie, dass gemäß GTG (Gentechnikgesetz) §61-71 besondere Vorschriften bezüglich Patientenberatung und Datenschutz einzuhalten sind.
Eine Vorlage zur Unterfertigung durch den Patienten finden sie hier: Einverständnisserklärung zu genetischen Analysen
Ein vielleicht hilfreicher Download ist die Patienteninformation bzgl Hämoglobinopathien, bereitgestellt von "The Hemoglobinopathies Laboratory", Department of Human and Clinical Genetics, Leiden University Medical Center.
Für den Inhalt verantwortlich: Dr. Janne Cadamuro
Hämatologie-Leukämie-Diagnostik
(20.7.2002)
Zusätzlich zur bereits verfügbaren molekularbiologischen Bestimmung des Philadephia-Chromosomes (BCR-ABL, t(9;22)q(34;q11) sind nun Bestimmungen für zahlreiche Fusionsproteine verfügbar, die bei hämatologischen Erkrankungen von prognostischem Interesse sind und auch therapeutische Relevanz besitzen dürften.
Diese diagnostischen Bestimmungen sind in einem Schreiben, das unter "LEUKÄMIE-DIAGNOSTIK mittels RT-PCR"weiter unten zu finden ist, detailliert besprochen.
Seit der Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms (Ph1) wurden zahlreiche weitere Chromosomen-Aberrationen, die zur Bildung von Fusionsproteinen führen identifiziert. Zahlreiche dieser genomischen Mutationen spielen Schlüsselrollen in der Pathogenese von hämatologischen Systemerkrankungen, da sie die regelrechte Entwicklung und Funktion lymphoider und myeloischer Vorläuferzellen negativ beeinflussen. Typischerweise codieren die beteiligten Gene Transkriptionsfaktoren, aber auch Zellzyklusregulatoren, Signaltransduktionsmoleküle, Rezeptoren, oder Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor Moleküle.
Klinische Studien konnten nachweisen, dass einige der chromosomalen Aberrationen zur Risiko-Stratifizierung in ALL- und AML-Erkrankungsfällen herangezogen werden können. So sind z.B. t(9;22) – BCR-ABL – und 11q23 Aberrationen wie t(4;11) – MLL-AF4 – bei akuten lymphatischen Leukämien mit einer schlechten Prognose assoziiert. Andererseits zeigen t(8;21) – AML1-ETO – sowie t(15;17) – PML-RARA – und inv(16) – CBFB-MYH11 – bei der akuten myeloischen Leukämie einen günstigeren Krankheitsverlauf.
Die PCR Analyse der fusionierten Gene basiert auf der selektiven Amplifikation der tumorspezifischen Fusionstranskripte. Dies bedeutet, dass die Fusionen nicht auf der Ebene der Chromsomen-DNA sondern auf Ebene der von den fusionierten Genen transkribierten messenger RNA nachgewiesen wird. Da RNA – ganz im Gegensatz zur DNA – sehr rasch von zelleigenen Enzymen abgebaut wird, ist es nötig für die Untersuchung ausschliesslich frisch gewonnenes Zellmaterial (Blut, Knochenmark) heranzuziehen. Mit anderen Worten: der Präanalytik (= Probengewinnung mit anschliessendem raschen Probenversand) kommt eine wesentliche Bedeutung bei dieser Untersuchungstechnik zu.
In der Folge sollen folgende wichtige Translokalisationen kurz besprochen werden:
| Zytogenetik | Phänotyp | Prognose | |
| BCR-ABL | t(9;22)(q34;q11) | CML >95% ALL adult 10-30% All kindlich 2-10% selten AML, Lymphom, Meylom |
ei ALL schlecht |
| AML1-ETO | t(8;21)(q22;q22) | de-novo AML 8-12% FAB-M2 20-40 % |
gut |
| PML-RARA | t(15;17)(q22;q21) | AML FAB-M3 | mittel |
| CBFB-MYH11 | inv(16)(p13;q22) | de-novo AML 10% meist FAB-M4Eo auch: M2, M5 selten: M1, M6, M7 |
eher gut |
| TEL-AML1 | t(12;21)(p13;q22) | All (meist Precursor-B): kindlich 25% adult <2% |
gut |
| MLL-AF4 | t(4;11)(q21;q23) | All (meist Pro-B): kindlich 50-70% jugendlich 5% adult 5% |
schlecht |
BCR-ABL: t(9;22)(q34;q11)
Das Philadelphia Chromosom (Ph1)wurde 1960 von Nowell und Hungerford in Philadelphia erstmals beschrieben. 1965 konnten Brown und Doll zeigen, dass in durch Bestrahlung behandelten Mb. Bechterew Patienten eine aussergewöhnlich hohe Frequenz von Ph1 positiven CMLs anzutreffen war. Ursprünglich dachte man, dass es sich bei diesem Chromosom um eine Deletion am Chromosom 21 handelt. Mit in der Zwischenzeit stark verbesserten Färbemethoden konnte Rowley 1973 zeigen, dass es sich um eine reziproke Translokalisation zwischen den Chromosomen 9 und 22 – also nicht um eine Deletion von Chromosom 21 – handelt. Bei dieser Translokalisation entsteht das wohl bekannteste Fusionsprotein: BCR-ABL. Dabei fusioniert ein je nach Bruchpunkt variabler Anteil von BCR mit einem fixen Teil des Proto-Onkogens c-ABL. Beim Proto-Onkogen c-ABL handelt es sich um eine Tyrosinkinase ohne Rezeptorfunktion, die u.a. in der Regulation der Zelldifferenzierung und Zellteilung eine wichtige Rolle spielt. Durch die BCR-ABL Fusion entsteht eine konstitutiv aktive Tyrosinkinase, die nicht mehr der zellulären Kontrolle unterliegt.Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die BCR-ABL Fusionsproteine in ~95% aller CML Fälle, 10%-30% aller adulten (v.a. pro-B Zell) sowie 2-10% aller kindlichen ALL-Erkrankungen anzutreffen sind. Gelegentlich findet man die Translokalisation auch in AML-, Lymphom- und Myelom-Erkrankungsfällen.Während die Bruchpunkte auf Chromosom 9 fast stets im sehr langen Intron 1 – also vor Exon 2 – des ABL Gens liegen, differieren diese in ihrer Position innerhalb des BCR Gens. Durch diese Variabilität, die durch drei über den BCR Genlocus verstreute „Breakpoint Cluster Regionen“ (bcr) – i.e. Maior-, Minor und Mikro-bcr – verursacht wird, entstehen BCR-ABL Fusionsproteine mit einem variablen molekularen Gewicht von ~190 bis ~230 Kilodalton (kDa). In fast allen CML Erkrankungen, in ~40% aller Ph1 positiven adulten ALLs sowie 20-30% dieser kindlichen Form findet sich der Breakpoint innerhalb des „Maior“-bcr (M-bcr), auch als BCR Exons 12-16 bekannt. Genaue Analysen zeigten, dass fast alle CML Patienten den BCR-Bruchpunkt in den Exons 13-15 (auch b2-b4 genannt) aufweisen. Durch Fusion mit ABL Exon 2 (auch a2 genannt) entstehen unterschiedliche Hybridtranskripte. Die Fusionen b3-a2 (55%) und b2-a2 (40%) stellen somit die bei weitem häufigsten Varianten bei der CML dar. In fast allen übrigen Fällen (~5%) kommt es im Anschluss an eine b2-a2 Fusion durch alternatives Splicing zum Auftreten zweier Transkripte: b2-a2 und b3-a2, die beide für Fusionsproteine mit einem molekularen Gewicht von ~210 kDa – auch p210BCR/ABL genannt – codieren. Der zweite Breakpoint-Cluster wird fast ausschliesslich in Ph1 positiven ALL Erkrankungen gefunden. Während wie bereits erwähnt 40% dieser ALLs ebenfalls Rearrangements im M-bcr zeigen, findet man in den übrigen Fällen eine Beteiligung der „Minor Breakpoint Cluster Region“ (m-bcr). Dadurch fusioniert BCR Exon 1 (e1) mit ABL Exon 2 (a2). Ergebnis ist ein kleineres Fusionsprotein mit einem Gewicht von 190 kDa (p190BCR/ABL). Die p190 Form kann auch bei der CML angetroffen werden – entweder als alleiniges Transkript (selten), oder durch alternatives Splicing verursacht zusammen mit dem längeren p210-Transkript. Sehr selten findet man Rearrangements mit Beteiligung der BCR „Mikro Breakpoint Cluster Region“ (µ-bcr). Hierbei fusioniert typischerweise BCR Exon 19 (auch c3 genannt) mit ABL Exon 2 (a2). Das Fusionstranskript codiert für das grösste BCR-ABL Protein (p230BCR/ABL). Anzumerken ist noch, dass in einer kleinen Anzahl der Erkrankungsfälle die soeben beschriebenen Breakpoint-abhängigen BCR-Anteile nicht mit ABL Exon 2 (a2) sondern mit ABL Exon 3 (a3) fusionieren.Für den Krankheitsverlauf ist von Bedeutung, dass Fusionsproteine mit einem kleineren BCR-Anteil – z.B. p190BCR/ABL – eine schlechtere Prognose aufweisen. CMLs mit dieser Variante zeigen häufig eine absolute und relative Monozytose, nicht selten das klinische Bild einer Mischform CML/chronische myelo-monozytären Leukämie. Typisch für das p230BCR/ABL Rearrangement ist der relativ indolente klinische Verlauf, der v.a. durch eine gestörte terminale Differenzierung der Granulozyten charakterisiert ist. Hinzuzufügen bleibt, dass nach derzeitigem Wissensstand kein signifikanter prognostischer Unterschied zwischen den beiden p210BCR/ABL Varianten b2-a2 und b3-a2 zu bestehen scheint. Ganz allgemein zeigen BCR-ABL positive ALL-Erkrankungen ein aggressives klinisches Bild.
AML1-ETO: t(8;21)(q22;q22)
Die Translokalisation wurde erstmals 1973 von Rowley in einem Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie beschrieben.AML1 (Acute Myeloid Leukemia 1 Gene) fusioniert dabei mit ETO (Eight Twenty One Gene; Translokalisation der Chromosomen Eight/Twenty-One). Dabei kommt es regelmässig zu einer Fusion von AML1-Exon 5 mit ETO-Exon 2. Wie der Name „Acute Myeloid Leukemia 1 Gene“ schon vermuten lässt, ist dieses Gen auch an zahlreichen anderen Rearrangements beteiligt (einige wichtige Fusionspartner: EVI1, EAP, MDS1, TEL, MGT16).Die Translokalisation wird in 8-12% aller neuen AML-Erkrankungen gefunden (v.a. bei jüngeren Patienten). Typischerweise wird sie in 20-40% der AML FAB-M2 Subtypen (= akute Myeloblasten-Leukämie mit beginnender Ausreifung) angetroffen. Beschrieben wurde die Translokalisation auch in seltenen Fällen von AML-M1 und AML-M4 sowie in therapieinduzierten (t-AML) Erkrankungen (z.B. Topoisomerase II-Inhibitoren).Die AML1-ETO Translokalisation ist mit einer relativ guten Prognose assoziiert – insbesonders einem guten Ansprechen auf bestimmte Chemotherapeutika (z.B. C-Ara).
PML-RARA: t(15;17)(q22;q21)
Vier Gruppen gelang es 1990 zeitgleich die an der Translokalisation beteiligten Gene zu identifizieren. Es handelt sich bei den Fusionspartnern um die Transkriptionsfaktoren PML und Retinoic Acid Receptor-alpha (RARA). Während der Bruchpunkt im RARA-Gen relativ konstant ist (Intron 2), gibt es am PML Locus drei involvierte „breakpoint regions“ (bcr): Intron 6 (bcr1; 55% aller Fälle), Exon 6 (bcr2; 5%) und Intron 3 (bcr3; 40%). Dies und die zusätzliche Möglichkeit des alternativen Splicings sind auch für die grosse Heterogenität der PML-RARA Fusionen verantwortlich, die derzeit jedoch noch nicht eindeutig unterschiedlichen klinischen Verlaufsformen zugeordnet werden können.Die Translokalisation ist typischerweise mit einer akuten Promyelozyten-Leukämie (APL), AML FAB-M3, assoziiert.
CBFB-MYH11: inv(16)(p13;q22)
Die chromosomale Veränderung wurde erstmals 1982 als Deletion del(16)(q22) bei einer AML beschrieben. Kurz darauf wurde gezeigt, dass es sich vielmehr um eine Inversion handelt, die das CBFB Gen (Core Binding Factor Beta) mit dem MYH11 Gen (Myosin Heavy Chain 11) fusioniert. Zahlreiche verschiedene CBFB-MYH11 Fusions-Transkripte wurden bis jetzt beschrieben, wobei mehr als 85% aller Fälle das Transkript vom Typ A aufweisen. Zwei weitere Transkripte (Typ D und E) repräsentieren ungefähr je 5%, alle übrigen stellen Einzelfälle dar.Die CBFB-MYH11 Transkripte werden in fast 10% aller de novo AML Erkrankungen angetroffen. Die Hälfte davon entspricht dem AML FAB-M4Eo Subtyp. Die Inversion ist also auch in weiteren AML-Typen wie M4 ohne eosinophile Veränderungen, M2, M5, seltener auch in M1, M6 und M7 anzutreffen. In sehr seltenen Fällen findet man die Inversion auch in der CML-Blastenkrise, myelodysplastischen Syndromen und therapieinduzierten AML-Formen.Die Inversion weist in vielen Fällen eine relativ gute Prognose auf, obwohl dies nicht generell gültig zu sein scheint.
TEL-AML1: t(12;21)(p13;q22)
Das Rearrangement wurde erstmals 1995 von zwei Arbeitsgruppen beschrieben. Die späte Entdeckung ist darauf zurückzuführen, dass die Translokalisation – obwohl diese mit ca. 25% die häufigste genomische Aberration in kindlichen ALL Erkrankungsfällen darstellt – mit konventioneller Zytogenetik nicht zu identifizieren ist. Der Altersgipfel liegt bei 2-5 Lebensjahren (Bereich 1-12 Jahre), wobei alle einen Precursor-B Zell Immunphänotyp aufweisen: v.a. common-ALL und pre-B-ALL, seltener pro-B-ALL. Typisch ist auch die eher niedrige Lymphozytenzahl bei Diagnose. Die meisten zeigen auch eine Coexpression myeloischer Marker; 70-80% auch eine Deletion des zweiten, nicht rearrangierten TEL-Allels. Bis jetzt wurde die Translokalisation fast ausschliesslich in B-Zell Lymphomen beschrieben, wobei die Frequenz in adulten Erkrankungsfällen niedrig ist (<2%).Fast alle bekannten Fälle zeigen einen Breakpoint zwischen Exon 5 und 6 des auf Chromosom 12 lokalisierten TEL Gens. Bruchpunkte im AML1 Gen liegen typischerweise im sehr grossen Intron 1 bzw. gelegentlich auch in Intron 2. Dadurch entstehen in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle Transkripte in denen TEL Exons 1-5 mit AML1 Exons 2-9 fusionieren. Durch alternatives Splicing kommt es gelegentlich zum Skipping von AML1 Exon 2, so dass gelegentlich zwei unterschiedliche Transkripte in einem Patienten anzutreffen sind. Dieses Fehlen von Exon 2 wird natürlich auch bei einem in Intron 2 liegenden AML1-Breakpoint gefunden.Klinisch von Bedeutung scheint zu sein, dass die TEL-AML1 Translokalisation prognostisch als eher günstig anzusehen ist.
MLL-AF4: t(4;11)(q21;q23)
Diese Translokalisation ist in 50-70% aller kindlichen und ca. 5% der adulten ALL Erkrankungen anzutreffen. Assoziiert ist das Rearrangement mit dem Pro-B-ALL Phänotyp, sowie auch der Coexpression myeloischer Differenzierungsantigene.
Das MLL Gen, das einen Transkriptionsfaktor codiert ist in zahlreichen Translokalisationen involviert. So wurden bis jetzt ca. 20 verschieden Fusionspartner beschrieben. Die unterschiedlichen Fusionen werden v.a. in Pre-B-ALL, AML, MDS, einigen Fällen von T-ALL und sekundären Leukämien angetroffen.
Auch bei den MLL-AF4 Translokalisationen gilt, dass zahlreiche Fälle mittels konventioneller Zytogenetik nicht zu entdecken sind. Im Gegensatz zu vielen anderen Translokalisationen werden beim MLL-AF4 Rearrangement verschiedenste Fusionstranskripte angetroffen. Die Ursache dafür liegt in den zahlreichen verschiedenen Breakpoints, sowie den bei dieser Translokalisation häufig angetroffenem Vorgang des alternativen Splicings. Interessanterweise sind die unterschiedlichen Breakpoints relativ spezifisch für pediatrische, kindliche und adulte ALL Erkrankungen, also typisch für bestimmte Altersgruppen.
MLL-AF4 wurde von zahlreichen Gruppen als negativer prognostischer Faktor sowohl bei den kindlichen als auch bei den adulten ALL Formen beschrieben. Dieser negative Einfluss scheint sich aber durch eine high-dose Ara-C Induktionstherapie zu verbessern. Anzumerken bleibt noch, dass – obwohl vermutet – eine unterschiedliche prognostische Relevanz der unterschiedlichen MLL-AF4 Fusionsproteine bis jetzt noch nicht eindeutig gezeigt werden konnte.
Ab sofort sind auch folgende Rearrangements mittels PCR-Screening verfügbar. Nähere Informationen dazu auf Anfrage
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Chromosomen |
Fusionspartner |
typisches Vorkommen |
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t(X,11)(q13;q23) |
MLL1/AFX1 |
ALL |
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t(6,11)(q27;q23) |
MLL1/AF6 |
AML/APL |
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t(11,19)(q23;p13.1) |
MLL1/ELL |
AML/ALL (Pro-B) |
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t(10;11)(p12;q23) |
MLL1/AF10 |
AML |
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t(1;11)(p32;q23) |
MLL1/AF1p |
ALL (Po-B) |
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t(11;17)(p23;q21) |
MLL1/AF17 |
AML |
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t(9;11)(p22;q23) |
MLL1/AF9 |
AML (monoblastic) |
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t(1;19)(p12;q13) |
E2A/PBX1 |
ALL (Pre-B) |
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t(17;19)(p12;q13) |
E2A/HLF |
ALL (Pro-B) |
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t(12;21)(p13;q22) |
TEL/AML1 |
ALL (common, pre-B, pro-B) |
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t(8;21)(q22;q22) |
AML1/MGT8-ETO |
AML FAB-M2 (myeloblastic) |
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t(3,21)(q26;q22) |
AML1/EVI1 |
CML/AML (myeloblastic) |
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t(3,21)(q26;q22) |
AML1/MDS1 |
CML/AML (myeloblastic) |
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t(3,21)(q26;q22) |
AML1/EAP |
CML/AML (myeloblastic) |
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t(16,21)(p11;q22) |
TLS/ERG |
AML/ALL |
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t(15;17)(q21;q22) |
PML/RARalpha |
AML FAB-M3 |
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t(4;11)(q21;q23) |
MLL1/AF4 |
ALL (Pro-B) |
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t(11,19)(q23;p13.3) |
MLL1/ENL |
ALL |
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t(1,11)(q21;q23) |
MLL1/AF1q |
ALL (Pro-B) |
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t(9;22)(q34;q11) |
BCR/ABL |
CML/ALL (Pro-B) |
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t(9,12)(q34;p13) |
TEL/ABL |
ALL |
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t(5,12)(q33;p13) |
TEL/PDGFRbeta |
CML |
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t(12,22)(p13;q11) |
TEL/MN1 |
AML |
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t(6,9)(q23;q34) |
DEK/CAN |
AML (myelo-monoblastic) |
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t(9,9)(q34;q34) |
SET/CAN |
AUL |
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t(11,17)(q23;q21) |
PLZF/RARalpha |
APL |
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t(5,17)(q35;q21) |
NPM/RARalpha |
APL |
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t(3,5)(q25.1,q34) |
NPM/MLF1 |
AML (myelo-monoblastic) |
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inv(16)(p13;q22) |
CBFbeta/MYH11 |
AML FAB-M4Eo (myelo-monoblastic) |
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del(1p34)(40kb) |
SIL1/TAL1 |
T-ALL |
Leukämie-Diagnostik mittels RT-PCR
Ab sofort können im Zentrallabor eine Reihe von chromosomalen Rearrangements analysiert werden, die eine wichtige Rolle in der Pathogenese der ALL, AML sowie CML spielen. Die Anforderung von BCR-ABL, AML1-ETO, PML-RARA, CBFB-MYH11, TEL-AML1 und MLL-AF4 erfolgt online über ORBIS (B-Schein). Zusätzlich können auch zahlreiche weitere Translokalisationen in einem Screening-Verfahren bestimmt werden (siehe Anhang). Die Befunderstellung erfolgt üblicherweise innerhalb von 2-3 Arbeitstagen, wobei die Untersuchungen nicht als Notfallbestimmungen gedacht sind. Die Resultate werden den Einsendern in Form eines schriftlichen Befundes mitgeteilt. Zur Bestimmung ist ein EDTA-Blut Röhrchen abzunehmen, welches umgehend ins Zentrallabor zu bringen ist.
Neben den klassischen morphologischen Kriterien werden aufgrund der hohen Sensitivität künftig die molekulargenetischen Veränderungen der leukämischen Tumorzellen als sensitivste Marker für ein bestimmtes Aggressionspotential einer Leukämie zunehmend an Bedeutung gewinnen (Tabelle 1). So konnten klinische Studien nachweisen, dass einige der chromosomalen Aberrationen zur Risiko-Stratifizierung in ALL- und AML-Erkrankungsfällen herangezogen werden können. Unter anderem sollten z.B. ALL-Erkrankungen mit BCR-ABL und MLL-AF4 Translokalisationen bereits in der ersten Remission einer Transplantation zugeführt werden, da diese Varianten trotz initial gutem Ansprechen eine hohe Rückfallrate zeigen. Im Gegensatz dazu weisen TEL-AML1 Rearrangements bei Kindern eine >85%-ige Heilungsrate auch ohne Transplantation auf. Bei der AML zeigen AML1-ETO, PML-RARA und CBFB-MYH11 Fusionen einen günstigeren Krankheitsverlauf, sofern diese einer „Rearrangement-spezifischen“ Therapie zugeführt werden (Tabelle 2).
Mehrheitlich wird derzeit davon ausgegangen, dass die stetig zunehmenden Kenntnisse der molekularen Pathologie verschiedener Leukämieformen zu einem einschneidenden Wandel in der Behandlung führen werden – weg von der uniformen Therapie hin zu verfeinerten Therapieprotokollen, die auf spezielle molekulare Subgruppen zugeschnitten sind. Zusätzlich werden diese Kenntnisse auch die Entwicklung von spezifischen Medikamenten revolutionieren, und so den Grundstein für eine rationale tumorspezifische Therapie legen (Beispiel: Signal-Transduktions-Inhibitor STI571/Gleevec).
Seit der Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms (Ph1) wurden zahlreiche weitere Chromosomen-Aberrationen die zur Bildung von Fusionsproteinen führen identifiziert. Viele dieser genomischen Mutationen spielen Schlüsselrollen in der Pathogenese von hämatologischen Systemerkrankungen, da sie die regelrechte Entwicklung und Funktion lymphoider und myeloischer Vorläuferzellen negativ beeinflussen. Typischerweise codieren die beteiligten Gene Transkriptionsfaktoren, aber auch Zellzyklusregulatoren, Signaltransduktionsmoleküle, Rezeptoren, oder Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor Moleküle.
Die PCR Analyse der fusionierten Gene basiert auf der selektiven Amplifikation der tumorspezifischen Fusionstranskripte. Dies bedeutet, dass die Fusionen nicht auf Ebene der chromosomalen DNA, sondern auf Ebene der von den fusionierten Genen transkribierten messenger RNA nachgewiesen werden. Da RNA – ganz im Gegensatz zur DNA – sehr rasch von zelleigenen Enzymen abgebaut wird, ist es nötig für die Untersuchung ausschliesslich frisch gewonnenes Zellmaterial (Blut, Knochenmark) heranzuziehen. Somit kommt der Präanalytik (= Probengewinnung mit anschliessendem raschen Probenversand) eine wesentliche Bedeutung bei dieser Untersuchungstechnik zu. Stark erleichtert werden Lagerung und Transport der sonst kühlpflichtigen Proben durch spezielle auf dem Vacutainer-System basierende Blutabnahmesysteme (z.B. PAXgene), die auch einen längeren Transport bei Raumtemperatur ermöglichen.
| Methode | Nachweisgrenze |
| Morphologie | 10-² |
| Klassische Zytogenetik | 10-² |
| Fish | 10-² |
| Immunphänotypisierung | 10-³ |
| PCR | 10-5 bis 10-6 |
Bestimmung von intrazellulären und Oberflächen-Antigenen an Leukozyten
Derartige Bestimmungen werden mittels A-Schein auf folgende Anforderungen hin durch-geführt:
