Molekularbiologischer Erregernachweis

Hepatitis-C Genotypisierung
Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein lineares, einsträngiges RNA-Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es weist infolge einer hohen Mutationsrate eine ausgeprägte genetische Variabilität auf. Die Analyse der RNA-Sequenzen führte zur Einteilung  in Genotypen (1, 2, 3 ...) und Subtypen (a, b, c ...). Bisher wurden sechs Genotypen und ca. 30 Subtypen beschrieben, die eine unterschiedliche geographische Verteilung aufweisen. In Westeuropa liegt das Hepatitis-C-Virus in 23 % als Typ 1a, in 51 % als HCV 1b, in 6 % als HCV 2a, in 5 % als HCV 2b und in 15 % als HCV 3a vor. Der Genotyp 4 ist v. a. in Afrika vorherrschend, während die HCV-Genotypen 5 bzw. 6 in Südafrika bzw. in Hong Kong und Vietnam beschrieben wurden. Koinfektionen mit verschiedenen HCV-Genotypen sowie Superinfektionen mit einem heterologen HCV-Genotyp sind insbesondere bei polytransfundierten sowie bei Hämophilie-Patienten beschrieben. Je länger die Infektion besteht, desto mehr Virusvarianten entstehen. Das erklärt das schlechtere Therapieansprechen bei längerer Krankheitsdauer.

Unterschiede in der Virulenz der Genotypen oder Subtypen ließen sich bis heute nicht sicher nachweisen. Gesichert ist jedoch, dass der Genotyp 1 schlechter auf eine antivirale Therapie anspricht als die Genotypen 2 und 3. Neben der Bestimmung des HCV-Virustiters ist  daher die Bestimmung des HCV-Genotyps für die Therapieentscheidung von großer Bedeutung. Die derzeit gültige Therapieempfehlung ist eine 48-wöchige antivirale Kombinationstherapie mit pegyliertem Interferon (PEG-IFN) und 1000/1200 mg Ribavirin/Tag bei Patienten mit dem schwierig zu behandelnden Genotyp 1 (Abbildung 1), wobei die  dauerhafte virologische Ansprechrate (Sustained Virological Response, SVR) bei diesen Patienten nur bei etwa 50% liegt. Bei Patienten die mit HCV Genotyp 2 und 3 infiziert sind wird eine 24-wöchige Kombinationstherapie mit 800 mg Ribavirin/d empfohlen, die zur einer SVR von 80% führt (Abbildung 2). Neue Untersuchungen zeigen, dass die Therapie nach der Ansprechgeschwindigkeit modifiziert werden kann. Bei Patienten mit Genotyp 1 und 4 kann die Therapie auf 24 Wochen verkürzt werden, falls sie nach den ersten 4 Therapiewochen HCV-RNA-negativ werden. Umgekehrt sollte bei Patienten mit einem langsameren Ansprechen die Therapie verlängert werden, um Rezidive zu verhindern. Bei Patienten mit Genotyp 2 oder 3 kann die Behandlungsdauer auf 12–16 Wochen reduziert werden.

Der "Goldstandard" der HCV-Genotypisierung ist die Sequenzierung amplifizierter HCV-DNA. Am 5'-Ende des HCV-Genoms befindet sich eine ca. 340 Nukleotide umfassende, konservierte Region, die nach Amplifikation (RT-PCR) und direkter Sequenzierung des PCR-Fragments die Charakterisierung des Virus (Genotypisierung) ermöglicht.

Untersuchungsmaterial: Serum (2-3 ml)

Für den Inhalt verantwortlich: PD Mag. Dr. H. Oberkofler

Hepatitis B Genotypisierung/Resistenzbestimmung

Die chronisch aktive Hepatitis-B-Virus-Infektion führt bei etwa 30 Prozent der betroffenen Patienten zur Entstehung einer Leberzirrhose. Durch eine Therapie mit Interferonen (IFN) oder Nukleo(t)sidanaloga kann das Karzinomrisiko gesenkt und die Prognose verbessert werden. Verlauf und Therapie der Erkrankung sind, neueren Studien zu Folge, bei der Hepatitis B, ähnlich wie bei der Hepatitis C, vom viralen Genotyp abhängig. Daher sollte in Zukunft vor Therapiebeginn eine HBV-Genotypisierung durchgeführt werden. Die bislang bekannten 8 HBV Genotypen (A-H) werden durch Abweichungen im Genom > 8% definiert. Sie haben eine unterschiedliche regionale Verbreitung, wobei in Europa die Typen A, D und G dominieren.

Der Erfolg einer antiviralen HBV Therapie ist bei den Genotypen A und B größer als bei den Genotypen C und D (Lindh et al. 1999, Chan et al. 2003). Dies scheint u.a. für das Ansprechen von PEG-Interferon alfa-2b zu gelten, wo fast die Hälfte aller Patienten mit HBV-Genoytop A, aber nur 25% der Patienten mit HBV-Genotyp D ein virologisches Ansprechen mit dauerhafter Suppression der HBV-Replikation erreichen (Janssen et al. 2005). Bei Patienten mit HBV-Genotyp C wurde darüber hinaus ein erhöhtes Risiko für hepatozelluläre Karzinome (HCC) gefunden.

Mutationsanalyse bei Therapieversagen:
Für die Behandlung einer HBV-Infektion stehen neben Interferon Lamivudin, Adefovir und andere derzeit für Studien eingesetzte Nukleosidanaloga zur Verfügung.
Bei fehlendem Abfall der Viruslast oder erneutem Anstieg der Virämie unter Therapie sollte die Bestimmung von Resistenzmutationen im HBV-Polymerasegen durchgeführt werden. Unter Lamivudin ist nach dreijähriger Therapie bei bis zu 60 Prozent der Patienten mit der Entwicklung einer YMDD-Mutation (M552V / M552I) im HBV-Polymerasegen zu rechnen. Mit Adefovir kommt es nach zwei Jahren bei weniger als drei Prozent der Patienten zu einer Mutation im Polymerase-Gen (häufigste Mutation: N236T). Adefovir ist zudem bei Lamivudin-Resistenz wirksam.

Untersuchungsmaterial: Serum (2-3 ml)

Für den Inhalt verantwortlich: PD Mag. Dr. H. Oberkofler

HIV-Genotypisierung/Resistenzbestimmung

Ziel der antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) bei der Behandlung von AIDS ist es, die Vermehrung des HI-Virus zu hemmen, um das Fortschreiten der Erkrankung aufzuhalten. Angestrebt wird die Absenkung der Viruslast unter die Nachweisgrenze von 40 HIV-RNA-Kopien/ml Blut. Dabei stehen heute insgesamt fünf verschiedene Klassen von HIV-Medikamenten zur Verfügung: Nukleos(t)idhaltige reverse Transkriptasehemmer (NRTI), Nicht-Nukleosidhaltige reverse Transkriptasehemmer (NNRTI), Proteasehemmer (PI), Fusionsinhibitoren, CCR5-Rezeptorantagonisten und Integrasehemmer. Die spontane Mutationsrate des HI-Virus übersteigt die von eukaryotischen Zellen um das ca. 100-fache. Bei ineffektiver Kombinationstherapie führt der niedrige Selektionsdruck zusammen mit der Virusvariabilität zur Bildung von Resistenzen gegen die eingesetzten Inhibitoren und somit zum Therapieversagen.

Die Sequenzanalyse der HIV-1-Gene für die Protease und die Reverse Transkriptase ermöglicht, den Virus-Genotyp zu bestimmen, vorliegende Veränderungen (Mutationen) im Vergleich zur Wildtypsequenz an resistenz-relevanten Stellen zu erkennen und damit therapieresistente Stämme zu identifizieren. Anhand dieser Mutationen ist es auch möglich Vorhersagen über die Wirksamkeit von antiretroviralen Substanzen zu treffen. Je größer die Zahl der nachgewiesenen Resistenzmutationen gegen verschiedene Inhibitorenklassen ist, desto geringer ist die Chance, eine geeignete Folgetherapie zu finden. Im optimalen Fall kann man über die HIV-1 Resistenzbestimmung drei geeignete antiretrovirale Substanzen für eine Kombinationstherapie identifizieren. Die HIV-1 Resistenzbestimmung ist gemeinsam mit der Bestimmung der Viruslast und der Zahl der CD4+-Zellen somit ein wichtiges Hilfsmittel zur Optimierung der antiretroviralen Therapie geworden.
 
Aufgrund der Vielzahl an antiretroviralen Substanzen und der Komplexität der möglichen Mutationsmuster wurden Algorithmen für die genotypische Resistenzanalysen entwickelt, die auf regelbasierte oder bioinformatische Systeme aufbauen. Regelbasierte Interpretationshilfen beruhen meist auf in vitro und in vivo Daten umfangreicher wissenschaftlicher Studien und ermöglichen die direkte Analyse der DNA-Sequenz.

• Trugene HIV-1 resistance module (Siemens)
• HIV-Grade: http://www.hiv-grade.de
• Los Alamos: http://www.lanl.gov/
• Stanford-HIVdb: http://hivdb.stanford.edu/pages/asi/

Bioinformatische Systeme stützen sich auf mathematische Modelle, die auf Geno- und Phänotyp Korrelationen basieren (http://www.geno2pheno.org/). Da ein phänotypischer Resistenzfaktor ermittelt wird, spricht man vom virtuellen Phänotyp.

Untersuchungsmaterial: EDTA-Blut (2-3 ml)

Für den Inhalt verantwortlich: PD Mag. Dr. H. Oberkofler

EBV
(20.7.2002)

Epstein-Barr Virus
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist der Erreger der Infektiösen Mononukleose und ist auch mit mehreren Tumoren assoziiert. In den Epithelialzellen des Oropharynx und in B-Lymphozyten infizierter Personen persisistiert EBV meist lebenslang unter der Kontrolle von T-Zellen. Deshalb verlaufen Reaktivierungen bei immunkompetenten Personen meist subklinisch. Bei Störungen der T-Zell-Immunität kann es durch Proliferation der infizierten B-Zellen zu einer lymphoproliferativen Erkrankung kommen. Latente Virusmembranproteine (z.B. LMP1) können CD40-ähnliche Wachstumssignale vermitteln, was zu einer neoplastischen Transformation beitragen dürfte, sodaß poly- und monkolonale Lymphome entstehen können.
Ein Zusammenhang von EBV wurde auch mit dem Mb. Hodgkin vom gemischt zellulärem Typ, Tonsillarkarzinomen, T-Zell-Lymphomen, Magenkarzinomen, Thymomen und ZNS-Lymphomen in Patienten ohne Immundefizienz beschrieben. Nahezu alle ZNS-Lymphome in AIDS-Patienten sind mit EBV assoziiert. Der Zusammenhang von EBV mit Burkitt Lymphomen und Rachenkarzinomen ist gesichert, die Stärke der Assoziation ist durch geographische Faktoren bestimmt.
Bei Patienten unter Immunsuppression oder mit Immundefekten ist häufig zum Zeitpunkt der Infektion kein oder nur ein unvollständiger bzw. verspäteter Antikörpernachweis möglich. Der Nachweis von EBV-DNA im EDTA-Plasma weist auf eine produktive Infektion hin, während der Nachweis in Leukozyten bei negativer PCR-Analyse des Plasmas für einen erhöhten Anteil EBV-infizierter bzw. transformierter B-Zellen spricht. Eine extrazelluläre Freisetzung infektiöser Partikel findet im letzteren Fall kaum statt. Virale DNA ist daher in der Regel nicht im Serum oder Plasma nachweisbar und wird auch nicht im Urin ausgeschieden.
Der Virusnachweis mittels PCR gilt als die bevorzugte Methode in der Liquordiagnostik. Als Untersuchungsmaterial eignet sich Vollblut (2-3 ml oder 1 ml Serum), EDTA-Blut (2-3 ml), Liquor (1 ml). Rücksprache bei anderen Untersuchungsmaterialien.